质粒构建（质粒构建以及需要注意的事项）

1.载体构建

载体构建(vectorconstruction)：载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。

特点：当给质粒插入一段外源DNA片段后，它依然能够进行自我复制。

2.多克隆位点

多克隆位点（multiple cloning site, MCS），指的是包含数个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。不同酶的酶切位点可有重叠。单一酶切位点就是只有一种特定的百思特网酶能够识别并进行酶切的位点，多克隆位点一般是位于百思特网质粒上的一段序列，这段序列含有很多个酶切位点，但这些酶切位点每一个都被一种酶识别并酶切。

3.质粒构建

（1）质粒构建原理

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

（2）质粒构建方式

质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。

（3）质粒载体的制备

质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

4.一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

（1）选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。

（2）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：
目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

（3）实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位百思特网点）。

（4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

（5）两个酶切点至少隔上3个碱基。

（6）两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

（7）最好使用酶切效率高的酶。

（8）最好使用双酶切有共同buffer的酶。